PCR 조건과 결과에 영향을 미치는 여러 요소들
저번 포스팅들에서는 PCR 기본 원리, 실제 실험 과정과 방법 등을 알아보았다. 이번 포스팅에서는 PCR 조건과 결과에 어떠한 요소들이 어떻게 영향을 미치고, 실험을 진행할 때 그러한 요소들을 고려해야 하는 이유를 설명하겠다.
PCR 반응의 기본 구성 요소
이 글에서 PCR 반응의 기본 구성 요소란 주형 DNA, primer 쌍, DNA 중합 효소, dNTP를 뜻한다. 이것들이 PCR 실험에서 어떤 영향을 미치고 어떤 역할을 하는지에 대해서는 이전 포스팅들에 자세히 설명 해놓았으므로 이번 글에서는 PCR 실험에 영향을 미칠 수 있는 다른 요소들에 대해서 알아보도록 하겠다. PCR 반응의 기본 구성 요소들이 어떤 역할을 하는지 궁금한 분들은 이전 포스팅들을 참고하시면 되겠다.
PCR의 원리 2 – PCR 과정의 이해
PCR 과정의 이해 저번 포스팅에서는 PCR의 고안 배경과 내열성 DNA 중합 효소의 필요성에 대해 알아보았다. 참고하면 좋은 저번 포스팅 PCR의 원리 1 - 내열성 DNA 중합효소의 필요성 PCR이란?
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PCR 실험 방법/PCR 실험 과정
PCR 실험 과정 지난 시간에는 PCR 원리, DNA 복제 과정, 내열성 DNA 중합효소의 필요성, PCR 과정과 원리 등에 대해서 알아보았다. PCR의 원리 1 - 내열성 DNA 중합효소의 필요성 PCR의 원리 1 - 내열성 DNA
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PCR 반응과 조건에 영향을 미치는 다른 요소들
PCR 반응의 기본 요소들 외에 다른 요소들도 PCR 반응과 조건에 영향을 미칠 수 있다. 그런 물질들의 특성을 잘 이용하여 PCR 반응의 효율과 특이성을 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 즉, 첨가를 피해야 하거나 상황에 따라서 첨가를 해주면 좋은 요소들이다.
- KCl: 보통 PCR buffer에 들어있으며, primer와 주형 DNA의 결합(pairing)을 강화시킨다. 보통 50 mM의 최종 농도로 사용되며, 농도를 증가시키면 (100 mM) 1 kb 이하의 PCR 산물의 증폭 효율을 증가하고, 길이가 긴 PCR 산물의 증폭 효율은 감소하게 된다.
- Mg2+: DNA 중합 효소의 필수적 cofactor로 이 또한 PCR buffer에 포함되어 있다. dNTP의 첫 번째 인산에 결합하여 두 번째, 세 번째 인산기의 제거를 촉진해서 DNA 중합 효소가 phosphodiester 결합을 형성할 수 있게 도와준다. 보통 1.5-3.5 mM 농도로 사용되며, 고농도에서는 오히려 반응을 저해할 수 있어 적정 농도로 사용해야 한다.
- (NH4)2SO4: (NH4)2SO4도 보통 PCR buffer에 첨가된다. Primer와 주형 DNA 간 잘못된 결합으로 형성된 수소결합을 약화시켜서 PCR 반응의 특이성을 증가시킨다. 주로 16-20 mM 농도로 사용되고, PCR 산물이 5 kb 이상으로 길다면 KCl을 사용하지 않고 (NH4)2SO4와 Mg2+를 각각 16 mM, 3.5 mM로 사용할 때 증폭 효율과 특이성을 동시에 높을 수 있다.
- Betaine: PCR을 하다 보면 어쩔 수 없이 GC%가 높은 서열로 primer를 짜야 할 때가 있다. GC%가 높으면 primer의 Tm이 높아지고 주형 DNA의 2차 구조 형성에 문제가 생겨 증폭 효율이 떨어질 수 있다. Betaine은 GC%가 높은 주형 DNA 부분의 2차 구조 형성과 primer의 Tm을 낮춰주어 증폭 효율을 증가시킨다. 주로 0.5-2.5 M로 사용된다.
- DMSO: DMSO도 위에서 설명한 betaine와 같은 역할을 한다. 똑같이 GC%가 높은 주형 DNA 부분의 2차 구조 형성과 primer의 Tm을 낮춰주어 증폭 효율을 증가시키며, betaine과 DMSO를 같이 사용하면 증폭 효율이 더욱 개선되는 효과가 있다. DMSO는 주로 1-10%의 농도로 사용되는데, 만약 10% 이상의 농도가 첨가되면 오히려 DNA 중합 효소의 활성을 매우 감소시킬 수 있다.
- TMAC: Primer와 주형 DNA 간 비특이적인 결합을 최소화시키고 Tm 값을 높여 특이성을 증가시킨다. 주로 15-100 mM의 농도로 사용된다.
- BSA: DNA 중합 효소를 안정화 시키며, DMSO와 함께 사용하면 PCR 산물의 GC%가 높거나 여러 크기인 경우 증폭 효율을 증가시킨다. 주로 10-100 μg/mL의 농도로 사용된다.
- 7-deaza-2'-dGTP: GC%가 높은 PCR 산물을 증폭할 때, dGTP 대신 사용하면 증폭 효율을 높일 수 있다. 주로 dGTP 대신 75-100%로 사용한다.
- Non-ionic detergents: Triton X-100, Tween-20, NP-40과 같은 detergent들은 DNA의 2차 구조 형성을 억제하고, DNA 중합 효소의 활성을 증가시켜 증폭 효율이 높아지지만, 이들을 첨가하면 비특이적인 증폭 또한 증가된다. 보통 주형 DNA에 PCR 반응을 저해하는 SDS가 첨가된 경우 사용한다. 주로 Triton X-100은 0.1-1%, Tween-20은 0.5%, NP-40은 0.5%의 농도로 사용된다.