PCR 실험 방법/PCR 실험 과정

PCR 실험 과정

지난 시간에는 PCR 원리, DNA 복제 과정, 내열성 DNA 중합효소의 필요성, PCR 과정과 원리 등에 대해서 알아보았다.

PCR의 원리 1 - 내열성 DNA 중합효소의 필요성

PCR의 원리 1 - 내열성 DNA 중합효소의 필요성

 

PCR의 원리 2 – PCR 과정의 이해

PCR의 원리 2 – PCR 과정의 이해

 

이번 포스팅에서는 실제로 PCR 실험이 어떤 식으로 수행되는지 PCR 실험 과정에 대해서 알아보려고 한다. 실제로 PCR은 DNA 서열 크기 확인, DNA 서열 유무 확인, TA 클로닝, 클로닝 과정에서 primer의 overhang을 이용해 제한효소 타깃 서열이 붙은 DNA 절편 만들기, 유전자 가위의 서열 특이성을 위한 가이드 RNA 제작 등의 여러 목적으로 수행되는데, 어떤 목적으로 PCR을 수행하느냐에 따라, 어떤 PCR 산물이 필요하냐에 따라 실험방법이 조금씩 달라진다. 이번에 소개할 내용은 가장 기본적인 PCR 실험 과정이 되겠다.

 

재료 및 기기

먼저 PCR 실험 수행에 필요한 준비물부터 살펴보자.

• PCR cycler: PCR tube를 꽂을 수 있고, PCR tube안의 반응물에 사용자가 설정한 protocol대로 온도를 가해주는 기기이다.
• PCR tube: 아래 사진에서 보이는 tube, 낱개로 된 것과 8개가 이어진 것 등이 있다. 시료 양에 따라서 실험자가 무엇을 사용할지 정한다.

• Primer 쌍: 일반적으로 ‘primer 3’라는 웹에서 디자인하고 oligo DNA를 합성하는 회사에 의뢰하여 합성한다. 합성을 의뢰하면 primer를 동결 건조된 상태로 받게 되는데, Nuclease-free water를 이용해서 100 pmol/μL의 농도로 만들어 -20℃ 냉동고에 보관하다가 사용할 때는 일부를 10 pmol/μL로 희석해서 사용한다. PCR 반응물에서의 최종 농도는 0.2 pmol/μL이 되도록 한다. 다음에 PCR 목적에 따른 primer 디자인 방법에 대해서도 포스팅해보도록 하겠다.
• dNTP mixture: 4종류의 deoxy-nucleotide triphosphate가 같은 농도로 혼합된 시약이다. dATP, dTTP, dGTP, dCTP가 혼합되어 있으며, 보통 각 2.5 mM 농도로 합쳐서 10 mM 농도이고, 최종 농도가 200 μM이 되도록 사용한다.
• Polymerase buffer: 중합효소가 DNA를 중합할 때 필요한 마그네슘 이온 등이 포함되어 있으며 중합효소가 DNA를 중합하기 좋은 환경을 제공한다. 10X 혹은 5X의 농도의 시약을 사용하고, 최종 1X가 되도록 사용한다.
• DNA polymerase: DNA를 중합하는 내열성 효소이다.
• Pure water (Nuclease-free): Reaction volume을 맞추기 위해 필요, 3차 증류수를 사용해도 무방하다.
• Template DNA: 복제할 서열을 제공할 주형 DNA이다. 이 주형 DNA의 종류에 따라 필요한 DNA 양이 달라진다. Genomic DNA일 경우, 전체 서열에 비해 타깃 서열의 양이 굉장히 적어 많은 양의 DNA를 넣어주어야 한다. 반면, plasmid DNA나 viral DNA, nested PCR products 같은 경우, 타깃 서열이 적은 양의 DNA에도 상대적으로 많이 들어가 있어 적은 양의 DNA만으로도 PCR 반응이 원활하게 일어난다. 일반적으로 Genomic DNA일 경우 50-250 ng, plasmid DNA나 viral DNA 같은 경우 0.001-10 ng이 PCR 반응에 필요하다.

 

실험 방법

• Primer를 nuclease-free water로 working stock 농도 (10 pmol/μL)까지 희석한다.
  
• 아래의 표를 참조하여 Master Mix를 조제한다.

※ Master Mix란? 여러 변인이 있는 시약을 제외하고 공통의 시약들을 먼저 혼합한 것이다. 예를 들어 실험에 쓰일 template DNA가 10 종류이고, 나머지 시약은 공통으로 사용하며 PCR 반응은 한 template DNA당 1개의 반응으로 총 10개의 반응을 수행하는 실험이 있다. 이때 Master Mix는 template DNA를 제외한 나머지 시약들의 11회 반응분(총 반응 수+1)을 한 tube에 혼합한 것이다. 이를 10개의 tube에 [(총 반응량)-(DNA 넣을 volume)]만큼씩 분주한 후, 10개의 template DNA를 각각의 tube에 첨가하면 된다. 이와 같이 Master Mix를 만들어 PCR을 수행하면 pipetting에서 발생하는 실험적 오차를 굉장히 줄일 수 있다는 장점이 있다.

 

• Mastet Mix를 PCR tube에 분주하고, 나머지 시약도 각각 넣어준다.
• 이제 PCR cycler 전원을 켜주고 Reaction 설정 단계에서 Reaction volume을 설정하고, PCR protocol을 아래 표와 같이 설정해준다.

※ Annealing 온도는 Tm값 ([2*(A+T)+4*(G+C)-5]℃)을 기본으로 하고 더 많은 증폭을 원하면 온도를 낮게, non-specific band가 안 보이고 특이성을 높이려면 온도를 더 높게 설정하면 된다. 이러한 조건을 잡기 위해서 annealing 온도를 2-5℃씩 차이가 나도록 하는 gradient PCR을 수행하기도 한다.

※ Extension 시간은 일반적으로 1 kb (1,000개의 염기쌍을 뜻한다.) 당 1분이다. Pfu DNA polymerase를 사용할 경우 교정 기능으로 인해 extension 속도가 느리므로 기존 시간보다 조금 더 늘려주어야 한다.

 

• PCR 반응물이 들어있는 PCR tube를 PCR cycler에 꽂아주고 cycler의 lid를 닫은 후 PCR run을 진행한다.
• PCR이 완료되면 PCR products는 agarose gel 전기영동을 통해 확인한다.

※ 전기영동은 DNA의 염기 사이에 결합하는 EtBr이나 그 대체품들을 이용하여 DNA 염색하고 DNA가 (-) 전하를 띄는 전기적 성질을 이용해 agarose gel의 구멍을 통과하게 만들어 DNA가 서열의 길이에 따라 분리되도록 하는 방법이다. 나중에 자세히 다룰 기회가 있다면 다루도록 하겠다. 

 

 

이번 포스팅은 기본적인 PCR 실험이 진행되는 과정에 대해서 설명하였다. 다음 포스팅에서는 PCR에 영향을 미치는 요소, 케미컬들과 그것들의 성질을 이용한 PCR 응용 측면에 대해 작성해보도록 하겠다.