PCR의 원리 2 – PCR 과정의 이해

PCR 과정의 이해

저번 포스팅에서는 PCR의 고안 배경과 내열성 DNA 중합 효소의 필요성에 대해 알아보았다.
참고하면 좋은 저번 포스팅

PCR의 원리 1 - 내열성 DNA 중합효소의 필요성

 

이번 포스팅에서는 PCR이 어떠한 과정을 거쳐 수행되는지 알아보도록 한다.

PCR은 생명체의 DNA 복제 방법을 모방하여 소량의 DNA 시료가 포함하는 특정 서열을 다량으로 증폭하는 기술이다. 저번 포스팅에서 유추할 수 있듯이 생명체가 DNA를 복제할 때, 복제 1회 당 DNA는 2배로 늘어난다. PCR도 마찬가지로 DNA가 중합되는 복제 과정이 1회 끝날 때마다 타깃 DNA 서열의 양은 2배가 된다. PCR(중합 효소 연쇄반응)의 이름에서도 알 수 있듯이 이러한 DNA 복제 과정이 연쇄적으로 일어나고, 복제 cycle이 1회 끝날 때마다 DNA가 2배씩 늘어난다. 즉, cycle이 n 회 반복되면 이론상으로 2ⁿ 배의 DNA가 증폭된다고 볼 수 있다. 이러한 복제 cycle은 다음의 과정으로 구성된다.

1. Denature
2. Annealing
3. Extension

PCR-과정

 

Denature

내열성 DNA 중합 효소의 필요성에 대해 설명한 이전 포스팅에서 생명체 내에서 일어나는 DNA 복제 과정과 그 과정을 모방하고자 한 것이 PCR이라고 서술하였다. 그중 약 94℃ 이상의 열을 가하면 helicase를 첨가하는 것을 대체하여 간단하게 DNA 이중나선 구조를 분리할 수 있다고 설명하였는데, 이 과정이 바로 denature라고 한다. 이 단계는 첫 cycle에서 30초가량, 나머지 cycle에서는 5-10초가량 94℃ 이상의 열을 가하는 방식으로 수행된다.

 

Annealing

PCR을 수행하기 위해 필요한 준비물에 primer라는 것이 있다고 설명했다. 우리가 DNA를 복제, 증폭하기 위해서 사용하는 DNA 중합 효소는 몇 가지 특징을 가지고 있다. 첫 번째는 주형 DNA 가닥에 상보적인 염기를 붙인다는 것이고, 두 번째는 5’에서 3’ 방향으로 중합을 한다는 것이다. 여기서 5’과 3’은 deoxy-nucleotide의 당 탄소 번호이고, 3번 탄소의 OH에 새로 합성될 deoxy-nucleotide의 5번 탄소에 붙어있는 3인산이 결합해 phosphodiester 결합을 형성한다. 즉, DNA 중합 효소가 작동하기 위해서는 3’OH가 존재해야 한다는 것인데, 그 3’OH를 제공해 주는 것이 바로 primer이다. Primer는 우리가 증폭하고자 하는 DNA 서열의 양쪽 시작점 20 nucleotides 내외로 디자인되며 DNA의 증폭 범위를 지정하는 중요한 요소이다. 이러한 primer 쌍을 denature 단계에서 분리된 양 주형 DNA 단일 가닥에 각각 결합시키는 단계를 annealing이라고 한다. 이 단계에서는 denature 단계보다 온도를 낮춰 DNA 가닥 간에 수소결합이 이루어질 수 있도록 한다. 그 과정에서 primer가 주형 DNA 가닥에 결합하게 된다. Annealing 온도는 primer의 절반이 주형 DNA에 결합해 있는 온도(Tm)을 기본으로 보통 45-68℃ 범위에서 조절된다. Primer의 Tm은 primer의 염기 배열에 따라 달라지는데 A와 T 사이에서는 2개, G와 C 사이에서는 3개의 수소결합이 이뤄지기 때문이다. PCR 증폭 효율을 높이고자 하면 annealing 온도 낮추고, 증폭 서열의 특이성을 높이고자 한다면 annealing 온도를 높이면 된다.

 

Extension

PCR 과정에서 DNA 이중나선 구조가 분리되고, primer가 주형 DNA 가닥에 붙었다면, 그 다음은 DNA 중합 효소가 dNTP를 중합할 차례이다. 이 단계를 extension 단계라고 하는데,  이 단계에서는 위에서 설명하였듯 DNA 중합 효소가 주형 DNA 가닥에 상보적인 염기를 5'에서 3' 방향으로 중합한다. DNA 중합 효소가 활성을 가져야하는 extension 단계의 온도 조건은 DNA 중합 효소의 종류에 달려있다. PCR의 목적에 따라 서로 다른 중합 효소들이 사용되는데, 이전에 언급했던 Taq DNA 중합 효소의 경우 DNA 중합 과정에서 실수로 잘못 결합된 nucleotide를 교정할 수 있는 능력이 없어 오류로 인한 돌연변이 발생률이 상대적으로 높다. 반면, 고온성 고세균인 Pyrococcus furiosus에서 분리된 Pfu DNA 중합 효소의 경우 오류 교정 기능인 3' -> 5' Exonuclease 활성을 가지고 있다. 그래서 돌연변이 발생률이 낮지만 Taq DNA 중합 효소에 비교하면 중합 속도가 낮다는 단점이 있다. 이 두 DNA 중합 효소는 기능의 차이도 있지만 최적의 활성을 갖는 온도도 서로 다르다. Taq DNA 중합 효소의 경우 72℃에서 최적의 활성을 가지며, Pfu DNA 중합 효소는 68℃에서 최적의 활성을 갖고, 이러한 특성은 extension 온도 설정에 영향을 미친다. Extension 단계의 지속시간은 중합 효소의 중합 속도와 증폭하고자 하는 서열의 길이를 고려하여 설정되며 보통 1 kb 당 1분으로 설정한다.

 

 

이번 포스팅은 PCR 원리와 PCR 과정의 이해에 중점을 두었다.  때로는  원리와 과정을 이해했더라도 실제 실험을 진행할 때, 여러 난관에 부딪힐 수 있다. 다음 포스팅에서는 실제 PCR 실험이 어떤 식으로 수행되는지 알아보는 시간을 갖도록 하려한다.