PCR primer 디자인 1-primer 디자인할 때 고려해야 할 부분들
저번 포스팅에서는 PCR 조건이 어떤 물질들에 의해 영향을 받는지 살펴보았고, PCR 실험이 많은 요소들에 의해 영향을 받는다는 것을 알게 되었다. 그중에서 가장 중요한 건 primer 쌍이 아닐까? 개인적으로는 primer 쌍의 디자인만 잘해도 PCR 실험의 80%는 성공할 것이라 생각한다. 그렇다면 primer 쌍을 디자인할 때 고려해야 할 것에는 무엇이 있을까? 이번 포스팅에서 그것들을 알아보도록 하자.
Primer 길이
15-40 mer 정도로 실험 목적에 따라 다양한 길이로 디자인된다. 일반적으로는 18-22 mer가 가장 적절한 길이이다. Primer의 길이는 특이성을 갖기 위해 충분히 길어야 하지만, 너무 길어지면 Tm 값이 높아져 primer의 annealing에 문제가 생긴다. 길이가 17 mer인 primer와 인간 유전체의 결합에 대해서 생각해보면 인간 유전체 안에 17개 염기의 배열이 primer와 상보적일 확률은 (1/4)17이다. 인간의 유전체의 총량을 생각해보면 이론적으로 17 mer까지는 인간의 유전체 어딘가에 같은 서열이 있을 가능성이 존재한다.
Tm 값
Tm은 정의상 DNA 이중나선 구조의 절반이 해리되어 단일 가닥이 되는 온도이다. Primer의 GC 함량과 길이에 의해 결정되며, Tm이 높을수록 결합력이 높다는 것을 의미한다. 52-58℃ 범위 내의 Tm값으로 primer를 디자인하는 것이 좋으며, Tm값이 65℃ 이상이 되면 2차 annealing이 될 수도 있다.
GC 함량
Primer 내의 염기서열 중 (G+C)의 비율이 40-60%가 되어야 한다. 50% 전후가 가장 적절하다.
GC clamp와 3' 안정성
PCR 실험의 성패는 primer의 3' 부분에서 대부분 결정된다고 봐도 무방하다. 20 mer인 primer에서 19 개 염기가 제대로 결합해도 마지막 3' 쪽 1개 염기가 결합하지 않았다면 PCR 증폭이 되지 않는다(교정 기능이 없는 DNA 중합효소를 사용한 경우). 따라서 3' 쪽의 결합력을 높여주기 위해 3' 마지막 5개 염기에 결합력이 강한 GC가 1-2개 들어가도록 디자인해주는 것이 좋다. 이렇게 마지막 5 염기에 들어있는 1-2개의 GC를 GC clamp라 한다.
반대로 5' 쪽의 15개 염기가 결합하지 않아도 3' 쪽 5개 염기가 제대로 결합했다면 증폭이 시작된다. 이렇듯 3' 쪽의 결합력이 너무 강하면 5' 쪽의 염기서열과 상관없는 증폭이 일어나 오히려 특이성이 줄어들 수 있다. 따라서 5' 쪽은 결합력이 강한 GC 함량이 조금 높게, 3' 쪽은 비교적 낮게 primer를 디자인해서 5' 부분이 주형 DNA와 먼저 결합되도록 유도해야 한다.
Primer의 2차 구조
Primer 쌍 사이에서 일어나는 상보적 결합 (cross-dimer), 같은 종류의 primer끼리의 상보적 결합 (self-dimer)이 일어나지 않도록 primer 쌍의 염기서열을 고려하여 상보적인 부분이 없도록 디자인해야 한다. 또한 primer 가닥이 스스로 결합하여 헤어핀 구조를 형성하는 delta-G 값을 갖지 않도록 디자인해야 한다.
Repeat 서열
Primer 내에 ATATATAT와 같은 반복 서열이 없도록 디자인해야 한다. 또한 같은 염기가 5개 이상 연속해서 배열되지 않도록 디자인해야 한다.
주형 DNA 2차 구조
단일가닥의 DNA는 매우 불안정한 형태이기 때문에 2차 구조를 형성하기 쉽다. 증폭될 DNA 범위를 결정할 때, PCR 반응하는 온도에서 2차 구조를 형성하지 않는 부분을 선택하는 것이 좋다.
이렇듯 Primer를 디자인은 꽤나 많은 부분을 고려하여야 하기 때문에 은근히 복잡하고 귀찮은 과정이다. 하지만 저런 고려 사항들을 계산해주는 알고리즘을 이용하면 어떨까? 굉장히 쉽게 적절한 primer 쌍을 디자인할 수 있다. 다음 포스팅에서 실제로 프로그램을 이용해 primer 쌍을 디자인하는 방법에 대해서 알아보자.